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單細胞分析 樣品制備怎么破
作者: 來源:生物通 發布于:2014-8-19 11:19:08 點擊量:

         單細胞基因組學顧名思義,研究人員分離出單個細胞并裂解,然后擴增并測序基因組DNA。它所產生的組裝可能并非完整的,因為任何損失或擴增偏向都會導致序列數據丟失,不過,它帶來了其他方法無法獲得的信息。現在的問題是,如何分離單個細胞。

  物以稀為貴,這對于很多無法培養的細菌而言,更是如此。它們代表了珍貴的微生物種類。斯坦福大學的Stephen Quake教授曾說過,已經被培養的細菌種類不足1%

  鑒于無法培養的生物體在它們所居住的環境中扮演了關鍵的角色,這種信息鴻溝代表了一個重大的問題,Quake的團隊將其稱之為生物學中的“暗物質”問題。從更實際的角度來看,這些細胞也許含有新穎的酶以及生物學或藥學上有用的分子,如抗生素。

  研究人員已經設計出幾種策略來研究無法培養的微生物,包括16S rRNA測序和宏基因組學。不過,現在還有另一種越來越流行的方法:單細胞基因組學。

  單細胞基因組學顧名思義,研究人員分離出單個細胞并裂解,然后擴增并測序基因組DNA。它所產生的組裝可能并非完整的,因為任何損失或擴增偏向都會導致序列數據丟失,不過,它帶來了其他方法無法獲得的信息。現在的問題是,如何分離單個細胞。

單細胞分離策略

  據美國能源部微生物基因組學計劃的主管Tanja Woyke介紹,研究人員使用幾種方法分離單細胞,它們各有優缺點。

   Quake曾使用微流體方法來分離一種稱為TM7的無法培養微生物1。TM7是桿狀的,于是Quake及其團隊專門捕獲口腔微生物群落中的桿狀細菌。隨后他們通過核糖體RNA來追蹤所要的細胞。在35個分離的桿狀細菌中,4個都證明是TM7,他們對其中一個進行測序。

  Woyke認為,微流體方法有兩個主要優勢。第一,用戶能夠觀察他們正在分離的細胞,這讓他們能夠選擇特定的形態或表型,并將此信息與基因型相關聯。第二是擴增效率。單拷貝的細菌基因組顯然不夠用來測序,因此需要全基因組擴增。但并非所有片段都能同等擴增,一些可能會丟失。“一些研究表明,如果反應體積越小,那么單細胞基因組的回收就越好,覆蓋也更加均一,”Woyke說。

  盡管如此,微流體策略通常是低通量的,且只有少數實驗室能夠接觸到這種設備。一個商業化的選擇是FluidigmC1™單細胞自動制備系統,這個微流體系統能夠自動化分離和制備96個單細胞的測序文庫。不過,它只適用于哺乳動物細胞,目前不支持細菌分離。

  另一種單細胞分離方法是顯微操作,其中研究人員使用操縱桿驅動的玻璃毛細管來挑選單個細胞,并依次轉移到目的容器中。

  Woyke表示,她偶爾會使用這種方法,主要是在處理低復雜度的樣品時,在2010年發表的一篇文章中,她和她的同事對一種昆蟲的細菌共生體進行測序,根據它獨特的形態將其與另一種共生體分離2。“這就是主要優勢,”Woyke說。“你可以看到細胞。”不過,顯微操作的通量也非常低。若細胞能游動或有粘性,則很棘手。

受歡迎的FACS

  在微生物單細胞基因組學中,兩種比較少用的分離方法是激光捕獲顯微切割和連續稀釋,而Woyke對后者的評價是“最便宜且最不準確”的選擇。

  最流行的策略是熒光激活細胞分選(FACS)。比奇洛海洋科學實驗室(Bigelow Laboratory for Ocean Sciences)單細胞基因組學中心的主任Ramunas Stepanauskas使用兩臺FACS儀器,一臺是貝克曼•庫爾特的MoFlo™,另一臺是BDBD™ Influx™。他對細胞分選的看法是:“這是個非常強大且高通量的技術,經過了幾十年的開發和改進。它讓我們能夠在幾分鐘內處理數千個細胞。”

  與其他方法相比,FACS帶來了兩個主要優勢。其一是通量,流式系統能夠快速將單個細胞分選到384孔板中,這一速度是手動方法難以企及的。其二是FACS能夠按照特定條件來選擇細胞,如特定顏色、核酸或生物化學活性的存在。

   Woyke、Stepanauskas及其同事在2014年的《Nature Protocols》文章3中寫道:“由于其高的速度和通量,以及根據各種細胞特性分離單個細胞的能力……FACS已成為[單細胞基因組學中]首選的單細胞分離方法。”

  2012年,Stepanauskas通過將樣品與熒光標記的海帶多糖和木聚糖一起孵育,分離出能夠降解某些多糖的水生細菌4。他們還利用CTC5-氰基-2,3-芐基-四唑氯化物)富集具代謝活性的細胞。

   另一方面,傳統的FACS不可能捕獲你正在收集的各個細胞的圖像。而且由于它的體積比微流體方法更大,之后的擴增效率可能受影響,Woyke談道。她的解決方案是使用LabcyteEcho® 來代替傳統的液體處理系統,這一系統利用聲能來分配納升級液體,讓反應體積最小化。

  據BD Biosciences的副總裁Robert Balderas介紹,如今的細胞分選儀能夠根據多達20個參數(如細胞大小和顆粒度)來過濾細胞,顏色可達到18種。

  他認為,任何分選儀都能開展單細胞的工作,不過它們的能力有所不同。最重要的是用戶的需求。他們是否需要從復雜的混合群體中分離特定的細胞群,需要更復雜的分選策略,以及更多的顏色?“最重要的事情是科學,”他說。

遠離污染

   Woyke認為,單細胞基因組學成功的關鍵是清潔度。“污染是我們在單細胞基因組中的重大敵人,”她說。由于所使用的DNA量極少,痕量的污染也會在擴增后放大,因此從頭到尾都需要一個非常干凈的過程,一塊專門的區域,以及專門的移液器和液體處理系統。

  除此之外,用戶需要做的就是照著Protocol來做,這并不難。Woyke指出,有些公司如今提供專為單細胞基因組擴增而設計的超純試劑盒,能盡量避免污染問題。

  盡管如此,考慮到復雜性、儀器和數據分析問題,Stepanauskas認為單細胞基因組學方面的新手可能會考慮外包。“你需要專門的設備和訣竅才能做好。我不建議人們包攬一切,”他談道。 (作者 Jeffrey M. Perkel

參考文獻 

[1] Marcy, Y, et al., “Dissecting biological ‘dark matter’ with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated TM7 microbes from the human mouth,” PNAS, 104:11889-94, 2007. [PubMed ID: 17620602]

[2] Woyke, T, et al., “One bacterial cell, one complete genome,” PLOS ONE, 5[4]:e10314, 2010. [PubMed ID: 20428247]

[3] Rinke, C, et al., “Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics,” Nat Protocols, 9[5]:1038-45, 2014. [PubMed ID: 24722403]

[4] Martinez-Garcia, M, et al., “Capturing single cell genomes of active polysaccharide degraders: An unexpected contribution of Verrucomicrobia,” PLOS ONE, 7[4]:e35314, 2012. [PubMed ID: 22536372]



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