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lncRNA,大分子,大學問

  lncRNA大量存在于生物體中并具有多種生物學功能。在整個基因組轉錄產物中,lncRNA所占的比例遠遠超過編碼RNA所占的比例,通過與DNA、RNA、蛋白質的相互作用,在生命活動調控網絡中扮演著十分重要的角色。lncRNA目前是遺傳學研究的熱點之一。目前已有很多具有重要意義的研究成果,給了人們很多思考的空間,也帶來的更多的興趣和研究方向。但是同時呢,因為它的特殊性,也有很多問題擺在人們面前。

1、lncRNA簡介

  長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200 nt的RNA分子,不編碼蛋白,位于細胞核或胞質內。lncRNA在基因表達調控、物種進化、胚胎發育、物質代謝以及腫瘤發生等過程中均具有重要作用。

  目前,在人類和動物中關于細胞周期調控、免疫監視和胚胎干細胞多能性等過程發揮作用,以及多種疾病與lncRNA的異常表達或突變相關的研究有很多;關于lncRNA與包括腫瘤在內的疾病相關聯的證據可為疾病診斷和治療提供依據和靶點,對lncRNA功能的深入研究將使目前對細胞的結構網絡和調控網絡的認識帶來革命性的變化,具有不可估量的科學和臨床價值。與人類和動物相比,植物lncRNA研究仍處于起步階段,植物lncRNA的研究可能揭示控制植物生長和分化的未知新機制,lncRNA在植物開花、雄性不育、營養代謝、生物和非生物脅迫等多種生物過程中起著調節因子的作用。

2、根據目前的研究進展,lncRNA具有如下特征:

①lncRNAs通常較長,具有mRNA樣結構,經過剪接,具有polyA尾巴與啟動子結構,分化過程中有動態的表達與不同的剪接方式

②與編碼基因相比,lncRNA表達量更低

③lncRNAs啟動子同樣可以結合轉錄因子

④大多數的lncRNAs在組織分化發育過程中,都具有明顯的時空表達特異性

⑤在腫瘤與其他疾病中有特征性的表達方式

⑥lncRNA的亞細胞位置呈多樣化

⑦序列上保守性較低,但功能上具有一定的保守性;等等。

3、lncRNA分類

  由于非編碼RNA在序列、結構以及生物功能上的高度異質性, 目前存在多種分類方法。根據長鏈非編碼RNA基因在基因組上的位置,可將lncRNA分為以下幾類:

①基因間區長鏈非編碼RNA,即Large intergenic noncoding RNA,簡稱lincRNA,產生于兩個基因之間的區域

②內含子區長鏈非編碼RNA,即Intronic transcript,內含子lncRNA,來源于次級轉錄物的內含子區域(有時可能為mRNA前體序列)

③正義鏈長鏈非編碼RNA,即Sense lncRNA,正義lncRNA,與相同鏈的另一個蛋白質編碼基因的一個或多個外顯子相重疊

④反義鏈長鏈非編碼RNA,即Antisense lncRNA,反義lncRNA,與相反鏈的另一個蛋白質編碼基因的一個或多個外顯子相重疊

⑤雙向長鏈非編碼RNA,即Bidirectional lncRNA,雙向lncRNA,它的轉錄起始位點與相反鏈上編碼蛋白質基因的轉錄起始位點非常接近,但轉錄方向相反

圖1  四種不同類型lncRNA圖示

4、lncRNA功能

  一般來說,lncRNA可從表觀遺傳學、轉錄及轉錄后三種層面實現對基因表達的調控。

圖2 lncRNA不同層面調控功能圖示


1)表觀遺傳學調控-染色質重塑

  lncRNA可通過招募染色質重塑復合物至特定的基因組位點使其發生催化活性。如圖2a,HOTAIR21、Xist/RepA和Kcnqot1招募Polycomb complex至HoxD位點,使得X染色體或Kcnq1功能域的組蛋白H3第27位賴氨酸發生3甲基化(me3K27),誘導異染色質形成,從而抑制該區域基因表達。

2)轉錄調控

  lncRNA可通過多種機制進行轉錄水平調控,包括自身作為共調節因子、修飾轉錄因子活性、調節共調節因子的結合和活性等。lncRNA可靶向基因轉錄過程的不同環節,如轉錄激活因子、阻遏蛋白,包括RNA聚合酶II、甚至DNA雙鏈在內的轉錄反應成分來調節基因轉錄和表達。這些lncRNA可能形成一個包括轉錄因子的調控網絡,在復雜的真核生物中精細調控基因表達。如圖2b,lncRNA結合到基因cyclin D1上,招募RNA結合蛋白TLS來調控蛋白CBP和p300的組蛋白乙酰轉移酶活性,進而抑制cyclin D1轉錄;圖2c,超保守增強子轉錄出lncRNA-Evf2,該lncRNA能激活轉錄因子DLX2,進而調控基因Dlx6轉錄;圖2d,DHFR次要啟動子區域轉錄出的lncRNA與該基因主要啟動子區域結合形成三聚體,抑制轉錄因子TFIID結合,從而使基因DHFR發生沉默。

3)轉錄后調控

  互補的lncRNA與mRNA形成RNA雙鏈體可掩蓋mRNA內部與反式作用因子結合必須的主要元件,可能影響轉錄后基因表達的任何步驟,包括pre-mRNA的加工、剪接、轉運、翻譯、降解。圖2e中,反義lncRNA與剪接體(splicesome)中鋅指同源mRNA Zeb2的5'剪切位點結合,使內含子未被剪切掉,而該內含子序列中保留有內部核糖體進入位點(IRE位點),翻譯過程中識別并結合該位點,導致Zeb2基因表達和翻譯。


5、lncRNA作用機制

  lncRNA轉錄一般發生在生物體發育過程中特定的時間和特定的組織中,其轉錄本有可能作為信號分子、誘餌分子、引導分子、支架分子進一步調控其他基因的表達。目前lncRNA的作用機制還沒完全搞清楚,根據lncRNA參與的不同層面的基因調控網絡,可將其作用機制分為表觀遺傳水平調控、轉錄水平調控及轉錄后水平調控。

1)表觀遺傳水平調控

表觀遺傳水平的調控是真核生物基因表達的轉錄前水平調節,主要包括染色質的重塑、組蛋白修飾、DNA甲基化(基因組印跡)等,是基因表達調控過程中最重要的環節。具有調控作用的lncRNA通常與DNA、異染色質蛋白、組蛋白修飾酶及轉錄因子等結合而參與基因轉錄前水平調節。

2)轉錄水平調控

轉錄水平調控是真核基因表達調控的重要環節,是基因表達最主要的調控方式,基因轉錄過程是受到嚴密調節的。具有調控作用的lncRNA可通過調控鄰近蛋白編碼基因的轉錄、與轉錄因子相互作用、與DNA形成三螺旋復合物等作用而參與基因或者靶基因的轉錄水平調控。

3)轉錄后水平調控

轉錄后水平調控在基因表達過程中也起重要作用。具有調控作用的lncRNA可通過調控mRNA前體的可變剪接、被剪切成非編碼小RNA、調節mRNA穩定性和豐度以及通過ceRNA等作用參與基因轉錄后水平調控。目前已有許多的lncRNA,比如KPASP1、LINC-MD1、HULC、linc-ROR等都是通過競爭性內源RNA機制調節靶基因的轉錄水平。

6、lncRNA研究思路-

 

7、lncRNA功能研

  lncRNA較長,承載的信息量多,更容易形成高級結構,因此,lncRNA的功能具有多樣化和特異性強的特點。lncRNA的功能非常難研究,對其功能的探索研究采取了多種方式。

1)類似于miRNA,探討lncRNA功能可用gain/loss of function策略,過表達或沉默lncRNA后觀察表型。

    在構建lncRNA表達質粒時,需關注lncRNA是否在蛋白編碼基因的啟動子區域或3’-UTR區域,勿遺漏重要區段; 也可用siRNA等方法沉默lncRNA,經qRT-PCR或FISH等驗證后觀察其對疾病相關基因表達和對細胞表型等的影響。實際上,對基因表達或細胞表型的觀察也不是任意或無目標的。基于該lncRNA的GO分析等生物信息學手段有助于縮小觀察范圍。

2)lncRNA功能鑒定和細胞定位的比較熱門的一個技術是c-KLAN技術。

  c-KLAN是檢測lncRNA介導的各種細胞過程的調控的一種快速、簡便和可靠的途徑。

 c-KLAN技術即非編碼RNA沉默與定位分析(Combined knockdown and localization analysis of noncoding RNAs, c-KLAN)技術。該技術結合了非編碼RNAs敲除和定位分析的技術,針對目的lncRNA設計引物,將其逆轉錄成cDNA,PCR擴增cDNA,一方面對擴增產物進行體外轉錄, 生成dsRNA,用核糖核酸內切酶Ⅲ酶切dsRNA來制備esiRNA (endoribonuclease-prepared siRNA),用于對lncRNA進行功能缺失研究;另一方面用熒光標記的UTP對擴增產物進行體外轉錄,以制備正義或反義的FISH探針,用于對lncRNA進行定位分析。

3)通過lncRNA與蛋白質和DNA的相互作用,探討其功能與作用機制。

  通過互作的蛋白質研究lncRNA的方法如RIP(RNA-immunoprecipatation)技術,包括化學交聯RIP、nRIP(native RIP)和CLIP(UV-crosslinked immunoprecipatation)。它們通過特異的抗體結合核蛋白復合物捕獲lncRNA,并可與新一代測序技術結合。RIP-Seq和 CLIP-Seq(又稱HITS-CLIP)可用于lncRNA篩選和功能研究。

  通過lncRNA與DNA相互作用的檢測方法有 ChIRP(Chromatin isolation by RNA purification)、CHART(capture hybridization of RNA target)和ChRIP(chromatin RNA immunoprecipatation)等。由于lncRNA可通過形成二級或三級結構行使功能, 可采用RNase footprinting,Chemical Mapping,in-line Probing和SHAPE(selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension)等技術研究其功能域。

4)生物信息學方法預測lncRNA的功能始終是一個吸引人的研究方向。

  在正確預測的基礎上進行功能研究可節省時間,少走彎路。因為lncRNA保守性差,對其功能預測難度不小。有以下幾種策略:

①比較基因組學策略:盡管大部分lncRNA一級和二級結構不保守,仍有小部分是保守的,可根據結構保守性可推測功能相似性;

②與編碼基因進行共表達分析:這是一種應用較廣的策略;lncRNA可通過與蛋白的作用行使功能,可通過它與mRNA的共表達分析預測其功能;適用于基因組水平的分析,數據來源多為微陣列或高通量測序結果;

③通過與miRNA或蛋白的相互作用預測:這種策略只對部分lncRNA適用;通過miRNA推測lncRNA的功能,比如miRcode算法(http://www.mircode.org/mircode/);通過評估其潛在的互作蛋白推測其功能,比如在線算法catRAPID(http://big.crg.cat/gene_function_and_evolution/services/catrapid),該算法可用于預測RNA與蛋白質的相互作用,根據RNA和蛋白質的物理化學性質如二級結構、氫鍵和范德華力等來評估它們之間相互作用的傾向;

④ ceRNA調控網絡:通過研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之間的調控網絡預測lncRNA的功能。

相關的miRNA-lncRNA,protein-lncRNA,ceRNA調控網絡資源包括

(1)starBase平臺(http://starbase.sysu.edu.cn/mirLncRNA.php):構建了最全面的CLIP-Seq實驗支持的miRNA和lncRNA, Protein(RNA結合蛋白)和lncRNA (包括了lncRNA,pseudogene,circRNA)的調控關系網絡,構建了ceRNA調控網絡和提供了長非編碼RNA功能預測工具。

(2)DIANA-LncBase數據庫(www.microrna.gr/LncBase)構建了基于單個CLIP-Seq數據和計算機預測的miRNA和lncRNA調控關系。[Nucleic Acids Res. 2013 Jan;41:D239-45.]

3) miRcode(http://www.mircode.org/mircode/):一種可以搜索的界面軟件,可用來預測miRNA的靶點,當前的版本覆蓋了完整的GENECODE注釋的轉錄組,包括10419條已經注冊的lncRNA。

8、存在的問題

  目前,關于lncRNA的研究數據呈爆炸性增長,但仍存在諸多問題:

  ①尚無統一的命名原則;

  ②許多lncRNA的生物學功能尚未闡明;

  ③lncRNA作用機制多樣、復雜,不同的lncRNA研究結果之間的借鑒意義不高;

  ④lncRNA數據庫不夠全;

  ⑤用于lncRNA研究的新技術不多,尤其是系統地研究lncRNA的結構和功能,需要建立更多、更有效的研究方法;

等等。

 

附:lncRNA相關數據庫

參考文獻:

[1] Iwakiri J, Hamada M, Asai K. Bioinformatics tools for lncRNA research[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 2016, 1859(1): 23-30.

[2] Gallart A P, Pulido A H, Sanseverino W, et al. GREENC: a Wiki-based database of plant lncRNAs[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 44(1):D1161-D1166.

[3] Angrand P O, Vennin C, Le B X, et al. The role of long non-coding RNAs in genome formatting and expression.[J]. Frontiers in Genetics, 2015, 6:165.

[4] Laurent G S, Wahlestedt C, Kapranov P. The Landscape of long noncoding RNA classification[J]. Trends in Genetics, 2015, 31(5): 239-251.

[5] Laurent G S, Wahlestedt C, Kapranov P. The Landscape of long noncoding RNA classification[J]. Trends in Genetics, 2015, 31(5):239–251.

[6] Mercer T R, Dinger M E, Mattick J S. Long non-coding RNAs: insights into functions.[J]. Nature Reviews Genetics, 2009, 10(3):155-9.

[7] Ponting C P, Oliver P L, Reik W. Evolution and Functions of Long Noncoding RNAs[J]. Cell, 2009, 136(4):629-641.

[8] Ponting C P, Oliver P L, Reik W. Evolution and functions of long noncoding RNAs[J]. Cell, 2009, 136(4): 629-641.

[9] Wilusz J E, Sunwoo H, Spector D L. Long noncoding RNAs: functional surprises from the RNA world[J]. Genes & development, 2009, 23(13): 1494-1504.

[10] 黃小慶, 李丹丹, 吳娟. 植物長鏈非編碼RNA研究進展[J]. 遺傳, 2015(4):344-359.


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